Preparazione del campione:
Raccolta del campione: raccogliere campioni come sangue, tessuto, saliva e urina in base allo scopo dell'esperimento.
Estrazione del DNA: utilizzare un kit di estrazione del DNA dedicato per estrarre il DNA dal campione.
Preparazione della reazione PCR:
Primer di progettazione: coppie di primer specifiche di progettazione basate sulla sequenza target per l'amplificazione del DNA del modello.
Preparare la miscela di reazione: incluso DNA del modello, primer, tampone, DNA polimerasi, dNTPS (deossinucleoside trifosfati), mg 2+, ecc.
Imposta il programma PCR:
Impostazioni dello strumento PCR: immettere i parametri del ciclo PCR preimpostati, come temperatura di preriscaldamento di 95 gradi, temperatura di denaturazione (come 95 gradi), temperatura di ricottura (come 55 gradi), temperatura di estensione (come 72 gradi) e numero di cicli.
Reazione PCR:
Aggiungi campione: aggiungi la miscela di reazione al serbatoio o al chip di reazione PCR e ogni campione di solito ha un pozzo di reazione.
Eseguire la PCR: i cicli dello strumento PCR secondo il programma preimpostato, tra cui riscaldamento, raffreddamento, ricottura e fasi di estensione.
Analisi del prodotto:
Raffreddamento dopo l'amplificazione: dopo il completamento della PCR, il campione viene brevemente raffreddato a 4 gradi.
Separazione elettroforetica: utilizzare la tecnologia dell'elettroforesi su gel, come l'elettroforesi su gel di agarosio, per separare i prodotti PCR di diverse lunghezze.
Scansione di fluorescenza: i primer marcati in modo fluorescente emettono luce di una lunghezza d'onda specifica nel prodotto amplificato e lo strumento PCR legge questi segnali e li registra.
Elaborazione e interpretazione dei dati:
Software di analisi dei dati: utilizzare software specializzato per analizzare il segnale fluorescente e calcolare la concentrazione o la concentrazione relativa del frammento target.
Interpretazione dei risultati: in base alla curva PCR e alla base, determina se la PCR ha successo, se esiste il frammento target e quanto è.
Registrazione e conservazione dei risultati:
Registrare i risultati nel rapporto sperimentale e preservare correttamente i dati e i campioni originali.